黄芪多糖干预多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

多发性骨髓瘤：多发性骨髓瘤患者体内会出现恶性浆细胞大量增殖的情况，导致大量单克隆免疫球蛋白的出现，对患者的肾功能造成不同程度的损害，并容易导致高黏滞综合征、反复感染等。在疾病的发生和发展过程中，多发性骨髓瘤细胞的各项生物学活动均与骨髓微环境之间存在密切的关系。

黄芪多糖：黄芪中含有大量的黄芪多糖，是一种具有生物活性的物质。经过研究发现，黄芪多糖具有多种药理功效，包括抗氧化和抗肿瘤以及增强免疫力等。以往也有学者通过研究发现，黄芪多糖可以对骨髓间充质干细胞的增殖情况产生一定的影响。

背景：骨髓间充质干细胞可通过产生多种细胞因子，可以为骨髓瘤细胞的生长增殖提供一定的支持。

目的：探讨黄芪多糖对多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞增殖情况以及细胞因子分泌情况的影响。

方法：取正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓，通过密度梯度离心法分离得到骨髓间充质干细胞，行传代培养及鉴定。收集第3代骨髓间充质干细胞，使用酶标仪法描绘出生长曲线。使用MTT法及流式细胞术分别检测不同质量浓度(0.5，1，2，4，6，8 g/L)黄芪多糖对骨髓间充质干细胞增殖及细胞周期的影响。使用ELISA法检测细胞中白细胞介素1β和白细胞介素6的表达水平。

结果与结论：①正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞均呈现出CD34阴性和CD44阳性表达，表明所获得的是骨髓间充质干细胞；②正常人骨髓间充质干细胞倍增时间显著短于多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞；③当黄芪多糖干预的质量浓度为1和2 g/L时，多发性骨髓瘤组的细胞增殖率显著高于正常对照组；质量浓度为6和8 g/L时，细胞增殖率显著低于正常对照组；④与1 g/L黄芪多糖干预的正常人骨髓间充质干细胞相比，1 g/L黄芪多糖干预的多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的G₀ /G₁期所占比例较少，S期和G₂/M期所占比例增加；⑤多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的白细胞介素1β和白细胞介素6水平均显著高于正常人；⑥经0.5，1和2 g/L黄芪多糖干预后，多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞中的白细胞介素1β和白细胞介素6水平显著下降；⑦结果表明，一定质量浓度的黄芪多糖可以促进多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的增殖及白细胞介素1β和白细胞介素6水平的下降。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-7203-8559 (杨景柯)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 多发性骨髓瘤, 骨髓间充质干细胞, 黄芪多糖, 细胞增殖, 细胞周期, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells can produce a variety of cytokines to provide some support for the growth and proliferation of myeloma cells.

OBJECTIVE: To investigate the effects of astragalus polysaccharides on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells from patients with multiple myeloma and cytokine secretion.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by density gradient centrifugation from the bone marrow of a healthy volunteer and a multiple myeloma patient, and were cultured and identified. Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were collected, and the growth curve was depicted by the enzyme marker method. MTT method and flow cytometry were used to detect the effects of different concentrations (0.5, 1, 2, 4, 6, 8 g/L) of astragalus polysaccharides on the proliferation and cell cycle of bone marrow mesenchymal stem cells. The expression levels of interleukin-1β and interleukin-6 were detected by ELISA method.

RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells from both the healthy control and multiple myeloma patient showed negative expression of CD34 and positive expression of CD44. The obtained cells from two sources had the characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells. Cells from the healthy control had significantly shorter doubling time than those from the myeloma patient. After treated with 1 and 2 g/L astragalus polysaccharide, cell proliferation rate in the multiple myeloma group was significantly higher than that in the healthy control group; after treated with 6 and 8 g/L astragalus polysaccharide, the cell proliferation rate was significantly lower in the multiple myeloma group than in the healthy control group. After treated with 1 g/L astragalus polysaccharide, compared with the healthy control, the proportion of bone marrow mesenchymal stem cells from the multiple myeloma patient in G₀/G₁ phase was significantly decreased, while the proportions of cells in both S phase and G₂/M phase from the myeloma patient were significantly increased. Interleukin-1β and interleukin-6 levels of bone marrow mesenchymal stem cells from the patient with multiple myeloma were significantly higher than those of cells from healthy control. After intervention with 0.5, 1, 2 g/L astragalus polysaccharide, the interleukin-1β and interleukin-6 levels of bone marrow mesenchymal stem cells from the patient with multiple myeloma were all significantly decreased. In conclusion, a certain concentration of astragalus polysaccharides can promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and decrease the levels of interleukin-6 and interleukin-β in patients with multiple myeloma.

杨景柯，吕丰收，韩立. 黄芪多糖干预多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1396-1401.

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图/表（结果） 6

2.1 正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的形态接种后2 d，正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞均贴壁生长，形态无明显差异，均为长梭形或者三角形(图1)。

2.2 正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的鉴定结果流式细胞术结果显示，正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞均呈现出CD34阴性表达、CD44阳性表达。表明所获得的细胞均具有骨髓间充质干细胞特性(图2)。

2.3 正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的生长曲线 MTT结果显示，正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的倍增时间分别为59 h和87 h，差异有显著性意义(P < 0.05；图3)。表明多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞生长速度相对较慢。

2.4 不同质量浓度黄芪多糖对多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞增殖的影响 MTT检测结果显示，黄芪多糖质量浓度为1和2 g/L时，细胞增殖率显著高于正常对照组；质量浓度为6和8 g/L时，细胞增殖率显著低于正常对照组(P < 0.05；图4)。

2.5 黄芪多糖对多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞细胞周期的影响流式细胞仪结果显示，与正常对照组相比，1 g/L的黄芪多糖干预的多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的G₀/G₁期所占比例显著缩短，S期和G₂/M期所占比例均出现显著延长的情况(P < 0.05；图5)。

2.6 黄芪多糖对多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞细胞因子分泌的影响 ELISA结果显示，正常人骨髓间充质干细胞中白细胞介素1β、白细胞介素6水平显著低于多发性骨髓瘤患者(P < 0.05)。经0.5，1，2 g/L黄芪多糖干预后，多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞白细胞介素1β、白细胞介素6水平均显著下降(P < 0.05；图6)。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学研究。

1.2 时间及地点实验于2015年6至9月在河南医学高等专科学校病理学实验室完成。

1.3 材料正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓来自郑州大学附属肿瘤医院血液科。正常志愿者，男，42岁，健康状况良好。多发性骨髓瘤患者(参考文献[6]确诊)，男，39岁。实验相关方案均提交医院医学伦理委员会审核并批准，实验获得参与者及家属的知情同意。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞分离、培养与鉴定取正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓各5 mL，添加人淋巴分离液后常规离心，收集中间有相细胞层，利用DMEM培养液进行洗涤。将细胞接种在添加DMEM培养液(含胎牛血清)的培养瓶中，并置于二氧化碳孵育箱中进行孵育，常规换液并观察细胞生长情况。待细胞融合率达到80%以上之后，对细胞进行传代培养。收集第3代细胞，常规胰蛋白酶消化之后添加CD34、CD44标记的单克隆抗体，利用流式细胞仪进行鉴定。

1.4.2 骨髓间充质干细胞生长周期检测收集第3代细胞接种在96孔板上，连续培养7 d，每天取5孔添加MTT液进行孵育。之后去掉上清液，添加DMSO进行溶解。之后利用酶标仪进行检测，读取在490 nm处的吸光度值，绘制生长曲线。

1.4.3 细胞增殖检测取正常人与多发性骨髓瘤患者第3代骨髓间充质干细胞，接种在96孔板上，观察细胞生长情况，待贴壁之后添加不同质量浓度黄芪多糖，质量浓度分别为0.5，1，2，4，6，8 g/L，另取不添加黄芪多糖培养的第3代正常人骨髓间充质干细胞作为正常对照组。连续培养72 h，使用MTT检测，酶标仪分析 490 nm处的吸光度值。

1.4.4 细胞周期检测取正常人与多发性骨髓瘤患者第3代骨髓间充质干细胞，分别设为正常对照组和实验组，均接种在培养皿中，第2天换液后分组。正常对照组只行换液，不予以特殊处理。48 h后消化细胞，PBS洗涤，并利用乙醇进行细胞固定。实验组添加1 g/L黄芪多糖，其余操作同正常对照组。2组细胞均乙醇过夜固定，添加RNA酶，碘化丙啶染色，0.5 h后利用流式细胞仪进行细胞计数，获得不同细胞周期的比例情况。

1.4.5 细胞因子水平检测取正常人与多发性骨髓瘤患者第3代骨髓间充质干细胞，接种在12孔板板上。对照组正常培养，实验组细胞培养基中添加0.5，1，2 g/L的黄芪多糖。使用ELISA试剂盒进行白细胞介素1β和白细胞介素6水平检测。严格按照试剂盒说明书进行操作，加入稀释好后的标准品及待测样品各50 μL于反应孔内。立即加入50 μL的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37 ℃温育1 h。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。每孔加入80 μL亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加1次。每孔加入底物，轻轻振荡混匀，37 ℃温育10 min。避免光照。取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，加入终止液后应立即测定结果，并在450 nm波长处测定各孔的吸光度值。

1.5 结局观察指标正常人与多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞形态、生长曲线以及不同质量浓度黄芪多糖对多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞增殖、细胞周期和细胞上清液中白细胞介素1β和白细胞介素6水平的影响。

1.6 统计学分析运用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析。数据以x(_)±s表示。用Levene统计量进行方差齐性检验，多组间均数比较采用One-Way ANOVA分析，LSD-t 法检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在多发性骨髓瘤的发生和发展过程中，多发性骨髓瘤细胞的各项生物学活动均与骨髓微环境之间存在密切的关系^[7-8]。为此，在临床治疗多发性骨髓瘤的过程中，便可以考虑通过破坏多发性骨髓瘤细胞生长和增殖所需骨髓微环境的方式来达到抑制多发性骨髓瘤细胞增殖，进而治疗疾病的目的^[9-12]。

骨髓间充质干细胞是骨髓基质细胞的前体细胞，可以通过旁分泌方式或者与多发性骨髓瘤细胞进行直接接触的方式分泌各种细胞因子，进而对多发性骨髓瘤细胞的生长等产生一定的影响^[13-16]。因此可以以骨髓间充质干细胞为靶点，通过对其的有效干预，实现对骨髓微环境的改变^[17-19]。本实验进行了正常人及多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞分离与培养。经流式细胞术鉴定，可得两组细胞均呈现出CD34阴性表达、CD44阳性表达，表明所获得的2种细胞均为单一细胞，且具有骨髓间充质干细胞特性，且多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞生长速度相对较慢。因此，在对多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞进行干预的时候，需要考虑到其细胞周期及细胞增殖的特点^[20]。

既往研究发现，黄芪多糖可以对骨髓间充质干细胞的增殖情况产生一定的影响^[6]。此次实验中利用不同质量浓度黄芪多糖对多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞进行干预，发现1和2 g/L黄芪多糖可以有效促进细胞增殖，而6 g/L以上的黄芪多糖对多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞有明显的抑制效果。另外发现，1 g/L的黄芪多糖可以对细胞周期产生促进作用，促进细胞进入S期和G₂/M期。

多发性骨髓瘤患者体内会出现骨质破坏的情况。白细胞介素1β属于破骨刺激因子，可以对骨髓间充质干细胞产生刺进作用，促进其分泌多种细胞因子^[21-23]。本次实验结果也显示，多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞中白细胞介素1β和白细胞介素6水平显著高于正常人(P < 0.05)。而0.5，1，2 g/L的黄芪多糖干预使多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞中白细胞介素1β和白细胞介素6水显著下降。由于白细胞介素1β和白细胞介素6表达异常在多发性骨髓瘤发病机制中具有重要意义^[24]。

综上所述，多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞生长相对较慢，且白细胞介素1β和白细胞介素6表达水平上升。一定质量浓度的黄芪多糖可以促进多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的增殖及白细胞介素β和白细胞介素6水平的下降，继而有效地破坏多发性骨髓瘤细胞所处的骨髓微环境，并抑制其生长。